Pracownia Terapeutycznych Kwasów Nukleinowych

New paper just published:

Kulik, K.; Sadowska, K.; Wielgus, E.; Pacholczyk-Sienicka, B.; Sochacka, E.; Nawrot, B. Different Oxidation Pathways of 2-Selenouracil and 2-Thiouracil, Natural Components of Transfer RNA. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5956. Publication Certificate

Damian Kaniowski, Katarzyna Ebenryter-Olbinska, Katarzyna Kulik, Slawomir Janczak, Anna Maciaszek, Katarzyna Bednarska-Szczepaniak,
Barbara Nawrot and Zbigniew Lesnikowski: Boron clusters as a platform for new materials: composites of nucleic acids and oligofunctionalized carboranes (C₂B₁₀H₁₂) and their assembly into functional nanoparticles.

Grant NCN, nr umowy: UMO-2015/16/W/ST5/00413 SYMFONIA 3

Oligopodalne kompozyty kwasów nukleinowych i klasterów boru – nowy materiał dla bionanotechnologii
Kierownik grantu: prof. dr hab. Barbara Nawrot. Projekt realziowany we wspolpracy z Centrum Biologii Medycznej, Lider Konsorcjum prof. dr hab. Zbigniew Leśnikowski

Grant realizowany od 16.11.2015 do 15.11 2021

Celem projektu jest przeprowadzenie badań nad możliwościami tworzenia nanstruktur kwasów nukleinowych dekorowanych klastrami boru.

W latach 2015-2017 opracowano metodę syntezy dekorowanych klastrami boru oligonukleotydów antysensowych (B-ASO) skierowanych na mRNA białka EFGR. Zbadano ich potencjał inhibitorowy anty-EGFR w modelu Dual Fluorescence Assay (wykorzystując komórki HeLa i plazmidowy system ekspresyjny tj. plazmid fuzyjny EGRF z GFP oraz plazmid RFP) i wykazano ich wysoką aktywność, zależną od pozycji klastra boru w łańcuchu ASO, rodzaju klastra oraz jego pozycji w strukturze nukleozydu (2’O- lub N3).

W latach 2018-2020 zaprojektowano i zsyntezowano modele B-ASO zdolne do tworzenia struktur wyższego rzędu (tzw. Dipody zawierające dwie nici ASO połączone klastrem boru, oraz dipody do nich komplementarne). Metodą AFM i Cryo-TEM scharakteryzowano strukturę przestrzenną kompleksów tych B-ASO (pierscienie zawierające 6-12 dipodów). Zbadano ich potencjał inhibitorowy anty-EGFR w modelu DFP oraz w modelu endogennym (w komórkach A431). Ponadto metodą ICP MS wykazano zdolność nanostruktur B-ASO do wprowadzania atomów boru bez czynnika transfekcyjnego, co ma znaczenie w planowanych badaniach niszczenia komórek nowotworowych z wykorzystaniem naświetlania termalnymi neuronami w tzw. metodzie BNCT (Boron Neutron Capture Therapy).

W roku 2021 kontynuowane są badania nad kolejnymi modelami B-ASO, tzw. tripedami. Badania są w toku.

Publikacje:

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbinska, K. Kulik, S. Janczak, A. Maciaszek, K. Bednarska-Szczepaniak, B. Nawrot, Z. Leśnikowski. Boron clusters as a platform for new materials: composites of nucleic acids and oligofunctionalized carboranes (C2B10H12) and their assembly into functional nanoparticles. Nanoscale 7, 103-114 (2020)

D. Kaniowski, K. Kulik, K. Ebenryter-Olbińska, E. Wielgus, Z. Leśnikowski, B. Nawrot. Metallacarborane Complex Boosts the Rate of DNA Oligonucleotide Hydrolysis in the Reaction Catalyzed by Snake Venom Phosphodiesterase. Biomolecules, 10,718 (2020)

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbinska, K. Kulik, A. Maciaszek, Z. Lesnikowski, B. Nawrot. Nanostructured conjugates of DNA oligonucleotides and boron clusters as potential dual-action anti-EGFR and BNCT therapeutics. FEBS OpenBio, 9, 209, (2019)

K. Ebenryter-Olbinska, D. Kaniowski, M. Sobczak, B. A. Wojtczak, S. Janczak, E. Wielgus, B. Nawrot, Z. J. Lesnikowski. Versatile Method for the Site-Specific Modification of DNA with Boron Clusters: Anti-Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Antisense Oligonucleotide Case Chem. Eur. J., 23, 16535-16546 (2017)

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, M. Sobczak, B. Wojtczak, S. Janczak, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot. High boron-loaded DNA-oligomers as a potential boron neutron capture therapy and antisense oligonucleotide dual-action anticancer agents. Molecules, 22, #1393, 20 stron (2017)

Konferencje:

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, K. Kulik, A. Maciaszek, K. Maliszewska-Olejniczak, M. Gryziński, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot. Nanostructures of conjugates of antisense oligonucleotides and boron clusters as potential carriers for boron neutron capture therapy (BNCT). yBNCT, Helsinki, Finlandia, 26-29 września 2019 (prezentacja ustna)

D.Kaniowski, K.Ebenryter-Olbińska, K.Kulik, A.Maciaszek, Z.J. Leśnikowski, B.Nawrot, Nanostructures of conjugates of antisense oligonucleotides and boron clusters as potential dual – action therapeutic nucleic acids. IFF Spring School Forschugszentrum, Julich, Niemcy, 11-22 marca 2019 (plakat) 

D.Kaniowski, K.Ebenryter-Olbińska, K.Kulik, A.Maciaszek, Z.J. Leśnikowski, B. Nawrot, Nanostructured conjugates of DNA oligonucleotides and boron clusters as potential dual-action anti-EGFR & BNCT therapeutics. 44^th FEBS Congress, Kraków, Polska, 7-11 lipca 2019 (plakat)

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, K. Kulik, A. Maciaszek, Z.J. Leśnikowski, B. Nawrot. Nanostructured conjugates of DNA oligonucleotides and boron clusters as potential dual-action anti-EGFR therapeutic nucleic acids. 11th Joint Meeting on Medicinal Chemistry, Praga, Czechy, 27-30 czerwca 2019 (wykład) 

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, K. Kulik, M. Sobczak, S. Janczak, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot. Oligopods of antisense oligonucleotides with boron clusters: self-assembly and biological properties. XXIII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, UC San Diego, La Jolla, California (USA), 26-30 sierpnia 2018 (plakat)

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, K. Kulik, A. Maciaszek, Z.J. Leśnikowski, B. Nawrot. Conjugates of antisense oligonucleotides with boron clusters: new material for anticancer therapy. 8th Intercollegiate Biotechnology Symposium 'Symbioza’, Warszawa, 17-19 maja 2019 (prezentacja ustna)

K. Kulik, A. Maciaszek, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot, Optimization of click reaction conditions on solid support for synthesis of oligofunctionalized carboranes. XXI International Symposium „Advances in the Chemistry of Heteroorganic Compounds”, Łódź, 23 listopada 2018

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, K. Kulik, M. Sobczak, S. Janczak, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot, Composites of Nucleic Acids and Oligofunctionalized Carboranes: synthesis, physicochemical and biological properties. XXI International Symposium „Advances in the Chemistry of Heteroorganic Compounds”, Łódź, 23 listopada 2018

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, K. Kulik, A. Maciaszek, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot Klastery boru skoniugowane z kwasami nukleinowymi – nowy materiał dla bionanotechnologii. STM/AFM NANOSAM, Zakopane 28-02 grudnia 2018

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, K. Kulik, M. Sobczak, S. Janczak, Z. J. Leśnikowski and B. Nawrot, Synthesis and physico-chemical and biological properties of oligopods of boron clusters and antisense oligonucleotides. XI Ogólnopolskie Sympozjum Chemii Organicznej, Warszawa, 8-11 kwietnia 2018

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot. Anti-EGFR silencing activity of antisense oligonucleotides labeled with boron clusters XVIIth Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components Český Krumlov, Czechy, 4-9.06. 2017, prezentacja plakatu

K. Ebenryter-Olbińska, M. Sobczak, D. Kaniowski, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot Synthesis and physicochemical characterization of antisense oligonucleotides modified with boron cluster

XVIIth Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components Český Krumlov, Czechy, 4-9.06. 2017, prezentacja plakatu

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot. Heavily boron-cluster-modified anti-EGFR antisense oligonucleotides, I konferencja doktorantów PAN, Falenty, 23-25.06.2017

D. Kaniowski, K. Ebenryter-Olbińska, Z. J. Leśnikowski, B. Nawrot. Anti-EGFR antisense oligonucleotides conjugated with metallocarboranyl clusters  60 Zjazd naukowy Polskiego Towarzystwa Chemicznego, 18.09.2017, Wrocław.

Katarzyna Ebenryter-Olbińska, Zbigniew J. Leśnikowski, Barbara Nawrot. Post-synthetic modification of DNA-oligonucleotides with boron clusters using “click chemistry” methodology. X Jakub K. Parnas Conference, 10-12 lipca 2016, Wrocław

Damian Kaniowski, Barbara Nawrot. Development of a dual fluorescence assay for monitoring of anti-EGFR silencing activity of chemically modified oligonucleotides; construction of pGFP-EGFR fusion plasmid. Parnas Conference, 10-12 lipca 2016, Wrocław

Katarzyna Ebenryter-Olbińska, Zbigniew J. Leśnikowski, Barbara Nawrot. Post-synthetic modification of DNA-oligonucleotides with boron clusters using “click chemistry” methodology. 59. Zjazd PTChem, 19-23 września 2016, Poznań

Damian Kaniowski, Barbara Nawrot. Development of a dual fluorescence assay for monitoring of anti-EGFR silencing activity of chemically modified oligonucleotides; construction of pGFP-EGFR fusion plasmid. 59. Zjazd PTChem, 19-23 września 2016, Poznań

Katarzyna Ebenryter-Olbińska, Damian Kaniowski, Zbigniew J. Leśnikowski, Barbara Nawrot. Synthesis, physicochemical and biological properties of DNA oligonucleotides modified with boron clusters. XIX International Symposium “Advances in the Chemistry of Heteroorganic Compounds”, 25 listopada 2016

Grant NCN, nr umowy: UMO-2018/29/B/ST5/02509 OPUS 15

Dlaczego Natura wprowadziła selen do nukleozydów w pozycji wahadłowej bakteryjnych tRNA?

Kierownik grantu: prof. dr hab. Barbara Nawrot

Grant realizowany 24.01.2019-23.01.2022

Celem projektu jest zbadanie biologicznej funkcji selenonukleozydów obecnych w pierwszej pozycji antykodonu transferowych RNA (tRNA) obecnych w bakteriach.

W roku 2019 przeprowadzono badania, które wykazały że 5-podstawione 2-selenourydyny preferencyjnie tworzą pary z resztami guanozyny a nie adenozyny (Leszczynska et al. IJMS 2020), co ma znaczenie w efektywnego rozpoznaniu synonimowych antykodonów, zawierających jednostkę purynową 3’-terminalną (A lub G) przez antykodony tRNA zawierające Se2U. Zbadano i opublikowano proponowany mechanizm utleniania 2-seleno- i 2-tiouracylu (Kulik et al. IJMS 2020) i skonkuldowano, że same seleno- i tio-nukleozasady nie stanowią dobrych modeli do analizy procesu utleniania S/Se2U-tRNA w stresie oksydacyjnym.

W roku 2020 kontunuowano badania reaktywności Se2U oraz S2U wobec nadtlenku wodoru. Wykonano także badania uzupełniające do pełnego scharakteryzowania białka SelU, które katalizuje reakcję geranylowania S2U-RNA i reakcję selenowania geS2U-RNA.

W roku 2021 prowadzone są badania epitranskrptomu w bakteryjnych tRNA.

Publikacje

Kulik, K.; Sadowska, K.; Wielgus, E.; Pacholczyk-Sienicka, B.; Sochacka, E.; Nawrot, B. Different Oxidation Pathways of 2-Selenouracil and 2-Thiouracil, Natural Components of Transfer RNA. Int. J. Mol. Sci., 21, 5956. (2020)

Leszczynska G., Cypryk M., Gostynski B., Sadowska K., Herman P., Bujacz G., Lodyga-Chruscinska E., Sochacka E., Nawrot B. C5-Substituted 2-Selenouridines Ensure Efficient Base Pairing with Guanosine; Consequences for Reading the NNG-3′ Synonymous mRNA Codons. Int. J. Mol. Sci., 21, pii: E2882. (2020)

Konferencje / wykłady

Barbara Nawrot, C5-Substituted 2-Selenouridines Ensure Efficient Base Pairing with Guanosine; Consequences for Reading the NNG-3′ Synonymous mRNA Codons. Advances in Nucleic Acid Therapeutics and Related Compounds (on line), 15.10.2020, Łódź

B. Nawrot wykład na zaproszenie Komitetu Biologii Molekularnej Komórki PAN, Epitranskryptomika na poziomie tRNA, Posiedzenie Komitetu Biologii Molekularnej Komórki PAN, 6 marca 2020 r.

Grant NCN, nr umowy: UMO-2016/23/B/NZ1/02316 OPUS 12

Badanie uszkodzeń 2-tiourydyno-tRNA zachodzących w komórkach poddanych stresowi oksydacyjnemu.

Kierownik grantu: dr Małgorzata Barbara Sierant

Grant realizowany od 28.09.2017 do 27.09.2021

Celem projektu jest zbadanie czy w komórkach eukariotycznych pod wpływem stresu oksydacyjnego dochodzi do uszkodzeń tRNA, polegających na desulfuracji 5-podstawionej 2-tiourydyny (R5S2U), występującej w pozycji 1 antykodonu tRNA^Lys, tRNA^Glu i tRNA^Gln, z utworzeniem rybozydu 4-pirymidynonu (R5H2U) i urydyny (R5U).

W latach 2017-2020 prowadzono badania na komórkach drożdży Saccharomyce cerevisiae oraz na kilkunastu liniach ludzkich komórek nowotworowych. W celu wywołania stresu oksydacyjnego komórki podczas hodowli poddawano działaniu czynników utleniających, takich jak nadtlenek wodoru, arsenin sodowy czy podchloryn sodu, zastosowanych w stężeniach, w którym nie dochodziło do uszkodzenia i śmierci komórek. Wyznaczono poziom reaktywnych form tlenu jakie tworza się w komórkach pod wpływem zastosowanych czynników i mogą być przyczyną uszkodzeń komórkowych kwasów nukleinowych (w tym tRNA) i białek. Zaobserwowano, że zastosowanie warunków oksydacyjnych wobec komórek drożdży powodowało ubytek tRNA zawierającego modyfikację mcm5S2U w pozycji „wobble” pętli antykodonu, co mogło świadczyć o oksydacyjnym uszkodzeniu 2-tiourydyno-tRNA. Podjęto próby identyfikacji uszkodzonych nukleozydów w tRNA z komórek drożdży i ludzkich komórek nowotworowych metodą LC-MS/MS. tRNA wyizolowane z badanych komórek poddawano hydrolizie enzymatycznej a uzyskaną mieszaninę nukleozyców poddawano analizie masowej, bazując na zdefiniowanych wzorcach modyfikowanych nukleozydów typu R5S2U, R5H2U i R5U. Analiza LC MS/MS potwierdziła obecność poszukiwanych nukleozydów mcm5H2U i mcm5U, które mogą pochodzić z reakcji desulfuracji mcm5S2U, oraz niewielki spadek ilości mcm5S2U, co może być oznaką desulfuracji lub uszkodzeń enzymów odpowiedzialnych za modyfikację tRNA.
W roku 2021 Kontynuowane są badania mające na celu wyjaśnienie wpływu stresu oksydacyjnego na uszkodzenia tRNA w komórkach z deficytem enzymów systemu antyoksydacyjnego (SOD i Kat).

Publikacje

Malgorzata Sierant, Patrycja Komar, Rafal Szewczyk, Agnieszka Dziergowska, Elżbieta Sochacka, and Barbara Nawrot.^. Studies on the oxidative damage of wobble 5-methylcarboxymethyl-2-thiouridine in transfer RNAs. Acta Biochimica Pol. 65, S2, 18, 2018.

M. Sierant, R. Szewczyk, A. Dziergowska, K. Krolewska-Golinska, E. Sochacka, B. Nawrot. Studies on the 2-thiouridine-tRNA damage induced in the Saccharomyces cerevisiae yeast cells under oxidative stress conditions. FEBS OpenBio 9, S1, 190, 2019.

Konferencje:

Malgorzata Sierant,*Patrycja Komar, Rafal Szewczyk, Agnieszka Dziergowska, Elżbieta Sochacka, and Barbara Nawrot^. Studies on the oxidative damage of wobble 5-methylcarboxymethyl-2-thiouridine in transfer RNAs. Congress BIO2018, Gdańsk 18-21.09.2018.

M. Sierant, R. Szewczyk, A. Dziergowska, K. Krolewska-Golinska, E. Sochacka, B. Nawrot. Studies on the 2-thiouridine-tRNA damage induced in the Saccharomyces cerevisiae yeast cells under oxidative stress conditions. 44^th FEBS Congress, 6-11 lipiec, Kraków, Polska.

Grant NCN, nr umowy: UMO-2020/36/T/ST4/00485 ETIUDA 8

Oligonukleotydy antysensowe i ich nanostruktury skoniugowane z klastrami boru; charakterystyka fizykochemiczna i biologiczna – próby oszacowania potencjału badanych związków do zastosowania w terapii BNCT.

Kierownik grantu: mgr Damian Kaniowski

Grant realizowany od 01.10.2020 – 30.09.2021

Celem projektu jest zbadanie użyteczności w terapii BNCT nowych nośników boru, jakimi są konjugaty klasterów boru z krótkimi antysensowymi olignukleotydami DNA (B-ASO), w tym przypadku skierowanymi na gen EFGR. Badania BNCT zostaną przeprowadzone podczas stażu naukowego na Uniwersytecie w Pawii, Włochy.

INNE GRANTY

Granty dla młodych naukowców:

2020

Mgr Patrycja Szczupak: Badanie elementów rozpoznawania substratów do prenylowania S2U-RNA oraz prenylowych-RNA przez 2-selenourydyno syntazę tRNA.

Mgr Damian Kaniowski: Identyfikacja i charakterystyka białek komórkowych wiążących się do modelowych koniugatów azydków boranowych z biotyną.

Dr Katarzyna Ebenryter-Olbińska: Synteza koniugatów kwasów nukleinowych i klasterów boru funkcjonalizowanych cząsteczkami fluoresceiny, galaktozaminy oraz biotyny.

Dr Ewa Radzikowska-Cieciura: Identyfikacja elementów odpowiedzialnych za rozpoznanie substratu przez enzym tRNA 2-selenourydyno syntazę (SeIU) z E. coli podczas katalizowanej przez SeIU reakcji selenowania prowadzącej do przekształcenia odpowiedniego prenylowego-tRNA do Se2U-tRNA

2019:

Mgr Damian Kaniowski: Zbadanie aktywności hydrolitycznej 3’- i 5’-egzonukleaz w obecności oligonukleotydów antysensowych (ASO) dekorowanych klastrami boru.

• Modyfikacje w transferowych kwasach rybonukleinowych (dr Małgorzata Sierant, dr Katarzyna Kulik, dr Ewa Radzikowska-Cieciura, mgr Patrycja Szczupak).
  

Od kilku lat obiektem naszych zainteresowań są modyfikacje chemiczne nukleozydów znajdujące się w tzw. „pozycji wahadłowej” antykodonu w transportującym kwasie rybonukleinowym (tRNA). Nukleozydy występujące w tej pozycji pełnią niezwykle istotną rolę w prawidłowym odczycie informacji genetycznej w procesie biosyntezy białka. W szczególności interesują nas 5-podstawione 2-tiourydyny (R5S2U), występujące tylko w trzech rodzajach tRNA: specyficznych dla lizyny, kwasu glutaminowego czy glutaminy (tRNALys, tRNAGlu i tRNAGln). W badaniach realizowanych wspólnie z zespołem Prof. Elżbiety Sochackiej, odkryliśmy, że w warunkach stresu oksydacyjnego in vitro 2-tiourydyna ulega desulfuracji, tzn. usunięciu atomu siarki z cząsteczki, a produktami tej reakcji są urydyna (U) i nukleozyd 4-pirymidynonu (H2U), w którym nie ma już atomu siarki, a układ donorów i akceptorów jest odmienny od urydyny i 2-tiourydyny. Produkty reakcji desulfuracji 2-tiourydyny można potraktować jako uszkodzenie tRNA, ponieważ nie może prawidłowo pełnić swojej funkcji. Obecnie pracujemy nad wyjaśnieniem czy omawiany proces desulfuracji 2-tiourydyny występuje również w warunkach naturalnych, w komórkach eukariotycznych poddanych stresowi oksydacyjnemu.

Niedawno w naszym Zespole został odkryty mechanizm transformacji 2-tiourydyny (S2U) do 2-selenourydyny (Se2U) w łańcuchu RNA. Wykazaliśmy, że w pierwszym etapie S2U jest przekształcana w S-geranylo-2-tiourydynę stanowiącą związek pośredni w syntezie Se2U (Schemat poniżej). Oba te procesy są katalizowane przez bakteryjny enzym tRNA 2-selenourydyno syntazę (SelU). Obecnie prowadzimy badania, których celem jest wyjaśnienie na poziome molekularnym funkcji selenu w nukleozydach występujących w pozycji wahadłowej transferowego RNA.

Odkryty przez nas mechanizm transformacji 2-tiouryduno-tRNA do 2-selenourydyno-tRNA opublikowany został w roku 2018 w czasopiśmie FEBS Letters (Sierant et al. FEBS Lett. 592(13), 2248-2258, 2018).

• Koniugaty oligonukleotydów DNA z klastrami boru jako fragmenty budulcowe w syntezie terapeutycznych nanocząsteczek i nowych materiałów dla bionanotechnologii (dr Katarzyna Ebenryter-Olbińska, mgr Damian Kaniowski)
  

W ramach konsorcjum z Instytutem Biologii Medycznej PAN w Łodzi (zespół Prof. dr hab. Zbigniewa Leśnikowskiego) prowadzimy badania nad wytworzeniem nowych kompozytów bioorganicznych składających się z kwasów nukleinowych (DNA) oraz klasterów boru, zbadaniem ich właściwości fizykochemicznych oraz wykorzystaniem jako bloków budulcowych do tworzenia nanostruktur.

W ramach prowadzonych badań zajmujemy się m.in. syntezą modyfikowanych i niemodyfikowanych terapeutycznych oligonukleotydów antysensowych (ASO) skierowanych na gen receptora EGF, ich post-syntetyczną modyfikacją resztami karboranylowymi (o-karboranami i metalokarboranami) oraz charakterystyką spektralną uzyskanych związków (HPLC, MS, UV, CD). Realizacja projektu wymaga również prowadzenia syntez oligopodalnych bloków budulcowych (DNA-oligopodów/ oligofunkcjonalizowanych klasterów boru) metodą „na fazie stałej”, fizykochemicznej i biochemicznej charakterystyki otrzymanych oligopodalnych bloków budulcowych oraz badania ich zdolności do tworzenia struktur 2D i 3D, a także topologii tych struktur (AFM, Cryo-TEM). Istotny element realizowanego projektu stanowią badania biologiczne (m.in. ocena poziomu egzo- i endogennego białka EGFR w liniach nowotworowych, ocena cytotoksyczności, zmian proliferacyjnych, stabilności nukleolitycznej, stresu oksydacyjnego) przeprowadzane dla uzyskiwanych związków oraz nanostruktur.

• Krystalografia Biomolekuł (dr inż. Rafał Dolot)
  

Badania obejmują krystalizację, pomiary dyfraktometryczne monokryształów oraz rozwiązanie i udokładnienie otrzymanych struktur kwasów nukleinowych i oligonukleotydów, białek (głownie niałek z rodziny HIT) i ich kompleksów z wybranymi ligandami (modyfikowany aptamer trombiny skompleksowany z trombiną, białko FHIT z niehydrolizowanym analogiem Ap4A) oraz związków niskocząsteczkowych, np. pochodnych nukleozydów i nukleotydów oraz innych związków biologicznie aktywnych, m.in. potencjalnych leków. Poznanie pełnej struktury badanych cząsteczek oraz sposobu oddziaływań międzycząsteczkowych pozwala na określenie np. mechanizmu działania leków, czy mechanizmów aktywności enzymatycznej wybranych białek. W naszym Instytucie istnieje możliwość prowadzenia eksperymentów dyfrakcyjnych z wykorzystaniem promieniowania synchrotronowego na synchrotronach DESY (Hamburg, Niemcy) i BESSY (Berlin, Niemcy). Obecnie na terenie CBMiM trwają przygotowania do otwarcia pracowni dyfraktometrycznej wyposażonej w rentgenowski dyfraktometr monokrystaliczny i dyfraktometr proszkowy.

• Badania funkcji białek z rodziny HIT (białka triady histydynowej) w metabolizmie oligonukleotydów tiofosforanowych (dr hab. Agnieszka Krakowiak).
  

W ramach tego tematu wyjaśniony został mechanizm apoptozy indukowanej przez białko Fhit przy użyciu niehydrolizowalnych analogów Ap4A (oryginalnie zaprojektowanych i zsyntezowanych w naszym Dziale) i będących inhibitorami własności enzymatycznych badanego białka (Krakowiak et al., Biol.Med.Chem. 11 (2011) 5053). Ponadto, odkryto nowy region oddziaływania pomiędzy białkiem Fhit a substratem/analogiem substratu (Krakowiak et al. FEBS Lett. 591 (2017), 548).

W badaniach dotyczących fosforoamidazy Hint1 określono, jaka jest stereochemia hydrolizy wiązania P-N w pochodnych nukleozydowych amidotiofosforanów (Krakowiak et al. Chem.Comm. 2007, 2163). Ponadto, stwierdzono że Hint1 wykazuje także właściwości desulfurazy 5’-O-tiofosforanów nukleozydów i odkryto, że w tej reakcji wydziela się siarkowodór (Ozga et al. J.Biol.Chem. 285 (2010), 40809), o którym wiadomo że w warunkach fizjologicznych ma znaczenie w etiologii wielu chorób (np. nadciśnienie, choroba Alzheimera). Dalsze badania wykazały, że powyższa reakcja desulfuracji z udziałem enzymu Hint1 zachodzi również wewnątrz komórek (Rysunek poniżej, Krakowiak et al. BBA, 1840 (2014) 3357; Krakowiak et al., Biochem.Pharm. 163 (2019) 250), co może mieć znaczenie zarówno w terapii antysensowej z zastosowaniem tiofosforanowych analogów oligonukleotydów, jak również w możliwym zastosowaniu tiofosforanowych analogów nukleozydów jako donorów H2S w leczeniu pewnych chorób.

1. J. Guerra, A.-L. Valadao, D. Vlachakis, K. Polak, I. K. Vila, C. Taffoni, T. Prabakaran, A. S. Marriott, R. Kaczmarek, A. Houel, B. Auzemery, S. Déjardin, P. Boudinot, B. Nawrot, N. J. Jones, S. R. Paludan, S. Kossida, C. Langevin, N. Laguette, Lysyl-tRNA synthetase produces diadenosine tetraphosphate to curb STING-dependent inflammation. Science Advances 2020, 6, eaax3333.
2. Leszczynska G, Cypryk M, Gostynski B, Sadowska K, Herman P, Bujacz G, Lodyga-Chruscinska E, Sochacka E, Nawrot B. C5-Substituted 2-Selenouridines Ensure Efficient Base Pairing with Guanosine; Consequences for Reading the NNG-3′ Synonymous mRNA Codons. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2882.
3. Kaniowski D, Kulik K, Ebenryter-Olbińska K, Wielgus E, Leśnikowski Z, Nawrot B. Metallacarborane Complex Boosts the Rate of DNA Oligonucleotide Hydrolysis in the Reaction Catalyzed by Snake Venom Phosphodiesterase. Biomolecules. 2020;10(5):E718.
4. Kaniowski D; Ebenryter-Olbinska K; Katarzyna K; Janczak S, Maciaszek A, Bednarska-Szczepaniak K, Nawrot B, Lesnikowski Z. Boron clusters as a platform for new materials: composites of nucleic acids and oligofunctionalized carboranes (C2B10H12) and their assembly into functional nanoparticles. Nanoscale 2020, 12 (1), 103-114.
5. Kaleta B, Górski A, Zagożdżon R, Cieślak M, Kaźmierczak-Barańska J, Nawrot B, Klimaszewska M, Malinowska E, Górska S, Turło J. Selenium-containing polysaccharides from Lentinula edodes-Biological activity. Carbohydr Polym. 2019, 223:115078.
6. A. Krakowiak, D. Piotrzkowska, B. Kocon-Rebowska, R. Kaczmarek, A. Maciaszek: The role of the Hint1 protein in the metabolism of phosphorothioate oligonucleotides drugs and prodrugs, and the release of H2S under cellular conditions. Biochem. Pharm. 2019. 163: 250-259. (IF 4.235)
7. Rozga-Wijas, K; Sierant, M; Wielgus, E; B.J. Miksa: Polyhedral octasilsesquioxanes labelled with the photosensitive cationic phenosafranin dye as a new nanocarrier for therapy and cellular imaging. Dyes and Pigments, 2019, 161: 261-266. (IF 4.018)
8. Sierant M, Leszczynska G, Sadowska K, Komar P, Radzikowska-Cieciura E, Sochacka E, Nawrot B. Escherichia coli tRNA 2-selenouridine synthase (SelU) converts S2U-RNA to Se2U-RNA via S-geranylated-intermediate. FEBS Lett. 2018, 592(13): 2248-2258. (IF 3.386, MNiSW=30)
9. Olejniczak AB, Nawrot B, Leśnikowski ZJ. DNA Modified with Boron⁻Metal Cluster Complexes [M(C2B9H(11))2] -Synthesis, Properties and Applications. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(11): 3501. (IF 4.183)
10. Fraczek T, Kaminski R, Krakowiak A, Naessens E, Verhasselt B, PanethP. ” Diaryl ethers with carboxymethoxyphenacy l motif as potent HIV-1 reverse transcriptase inhibitors with improved solubility” J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2018, 33: 9-16. (IF 4.293)
11. M. Sierant, K. Kulik, E. Sochacka, R. Szewczyk, M. Sobczak, B. Nawrot: Cytochrome c Catalyzes the Hydrogen Peroxide-Assisted Oxidative Desulfuration of 2-Thiouridines in Transfer RNAs; ChemBiochem. 2018, 19(7): 687-695. (IF 2.593)
12. Dolot R, Lam CH, Sierant M, Zhao Q, Liu FW, Nawrot B, Egli M, Yang X. Crystal structures of thrombin in complex with chemically modified thrombin DNA aptamers reveal the origins of enhanced affinity. Nucleic Acids Res. 2018, 46(9): 4819-4830. (IF 11.147)
13. Leszczynska G, Sadowska K, Sierant M, Sobczak M, Nawrot B, Sochacka E. Reaction of S-geranyl-2-thiouracil modified oligonucleotides with alkyl amines leads to the N2-alkyl isocytosine derivatives. Org. Biomol. Chem. 2017, 15(25): 5332-5336. (IF 3.49)
14. Sochacka E, Lodyga-Chruscinska E, Pawlak J, Cypryk M, Bartos P, Ebenryter-Olbinska K, Leszczynska G, Nawrot B. C5-substituents of uridines and 2-thiouridines present at the wobble position of tRNA determine the formation of their keto-enol or zwitterionic forms – a factor important for accuracy of reading of guanosine at the 3΄-end of the mRNA codons. Nucleic Acids Res. 2017, 45(8): 4825-4836. (IF 11.147)
15. K. Ebenryter-Olbińska, D. Kaniowski, M. Sobczak, B. Wojtczak, S. Janczak, E. Wielgus, B. Nawrot, Z. J. Leśnikowski: Versatile method for the site-specific modification of DNA with boron clusters: anti-epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) antisense oligonucleotide case. Chem-Eur J. 2017; 23:(65): 16535-16546. (IF 5.16)
16. Kaniowski, D. ; Ebenryter-Olbińska, K.; Sobczak, M.; Wojtczak, B.; Janczak, S.; Leśnikowski, Z. J., and Nawrot, B. High boron-loaded DNA-oligomers as potential boron neutron capture therapy and antisense oligonucleotide dual-action anticancer agents. Molecules. 2017; 22:(9): E1393. (IF 3.06)
17. Dolot R, Sobczak M, Mikołajczyk B, Nawrot B. Synthesis, crystallization and preliminary crystallographic analysis of a 52-nucleotide DNA/2′-OMe-RNA oligomer mimicking 10-23 DNAzyme in the complex with a substrate. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2017, 36(4): 292-301. doi: 10.1080/15257770.2016.1276291.
18. A. Krakowiak, B. Kocoń-Rębowska, R. Dolot, D. Piotrzkowska: New interactions between tumor suppressor Fhit protein and a non-hydrolyzable analog of its AP4A substrate. FEBS Letters, 2017, 591: 548-559. (IF 3.386, MNiSW=30).
19. R. Dolot, R. Kaczmarek, A. Sęda, A. Krakowiak, J. Baraniak, B. Nawrot: Crystallographic studies of the complex of human HINT1 protein with a non-hydrolyzable analog of Ap4A. Int. J. Biol. Macromol. 2016, 87: 62-69. (Q2, IF=4.784, MNiSW(A)=25)
20. R. Pawlowska, D. Korczynski, B. Nawrot, W. J. Stec, A. Chworos: The alpha-thio and/or bet-gamma-hypophosphate analogs of ATP as cofactors of T4 DNA ligase. Bioorganic Chem. 2016, 67: 110-115. (Q2, IF=2.252, MNiSW(A)=20)
21. M. Duechler, G. Leszczyńska, E. Sochacka, B. Nawrot: Nucleoside modifications in the regulation of gene expression: focus on tRNA. Cell Mol. Life Sci. 2016, 73: 3075–3095 (Q1, IF=5.694 MNiSW(A)=40)
22. G. Leszczynska, K. Sadowska, P. Bartos, B. Nawrot, E. Sochacka: S-Geranylated 2-Thiouridines of Bacterial tRNAs: Chemical Synthesis and Physicochemical Properties. Eur. J. Org. Chem. 2016, 3482–3485. (Q2, IF=3.068, MNiSW(A)=35)
23. N. D. Abeydeera, M. Egli, N. Cox, K. Mercier, J. N. Conde, P. S. Pallan, D. M. Mizurini, M. Sierant, F.-E. Hibti, T. Hassell, T. Wang, F.-Wu Liu, H.-Min Liu, C. Martinez, A. K. Sood, T. P. Lybrand, Ch. Frydman, R. Q. Monteiro, R. H. Gomer, B. Nawrot, Xianbin Yang: Evoking picomolar binding in RNA by a single phosphorodithioate linkage. Nucleic Acids Res. 2016, 44: 8052-8064 (Q1, IF=9.202, MNiSW(A)=40)
24. R. Kaczmarek, A. Krakowiak, D. Korczyński, J. Baraniak, B. Nawrot: Phosphorothioate analogs of P1,P3-di(nucleosid-50-yl) triphosphates: Synthesis, assignment of the absolute configuration at P-atoms and P-stereodependent recognition by Fhit hydrolase. Bioorg. Med. Chem. 2016, 24: 5068-5075 (Q2, IF=2.923, MNiSW(A)=30)
25. M. Sierant, G. Leszczynska, K. Sadowska, A. Dziergowska, M. Rozanski, E. Sochacka. B. Nawrot: S-Geranyl-2-thiouridine wobble nucleosides of bacterial tRNAs; chemical and enzymatic synthesis of S-geranylated-RNAs and their physicochemical characterization. Nucleic Acids Res. 2016, (Q1, IF=9.202, MNiSW(A)=40)
26. T. Frączek, A. Paneth, R. Kamiński, A. Krakowiak, P. Paneth: Searching for novel scaffold of triazole non-nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2016, 31: 481-489. (IF 4.29, MNiSW – 25)
27. E. Sochacka, R. H. Szczepanowski, M. Cypryk, M. Sobczak, M. Janicka, K. Kraszewska, P. Bartos, A. Chwialkowska, B. Nawrot: 2-Thiouracil deprived of thiocarbonylfunction preferentially base pairs with guanine rather than adenine in RNA and DNA duplexes. Nucleic Acids Res. 2015, 43(5): 2499–2512.
28. A. Tomaszewska-Antczak, P. Guga, B. Nawrot, G. Pratviel: Guanosine in a Single Stranded Region of Anticodon Stem–Loop tRNA Models is Prone to Oxidatively Generated Damage Resulting in Dehydroguanidinohydantoin and Spiroiminodihydantoin Lesions. Chem. Eur. J. 2015, 21: 1–6.
29. M. Sierant, D. Piotrzkowska, B. Nawrot: RNAi mediated silencing of cyclin-dependent kinases of G1 phase slows down the cell-cycle progression and reduces apoptosis. Acta Neurobiol. Exp. 2015, 75: 1–12
30. N. Dyubankova, E. Sochacka, K. Kraszewska, B. Nawrot, P. Herdewijna, E. Lescrinier: Contribution of dihydrouridine in folding of the D-arm in tRNA. Org. Biomol. Chem. 2015, 13(17): 4960-6.
31. Maciaszek A., Krakowiak A., Janicka M., Tomaszewska-Antczak A., Sobczak M., Mikołajczyk B., Guga P.: LNA units present in the (2′-OMe)-RNA strand stabilize parallel duplexes (2′-OMe)-RNA/[All-RP-PS]-DNA and parallel triplexes (2′-OMe)-RNA/[All-RP-PS]-DNA/RNA. An improved tool for the inhibition of reverse transcription. Org. Biomol. Chem. 13:2375-84 (2015). (IF=3.56).
32. J. Baraniak, A. Pietkiewicz, R. Kaczmarek, E. Radzikowska, K. Kulik, K. Krolewska, M. Cieslak, A. Krakowiak, B. Nawrot. N-Acyl-phosphoramidates as potential novel form of gemcitabine prodrugs. Bioorg. Med. Chem, 2014, 22: 2133–2140. (IF 2.978)
33. S. Y. Wu, X. Yang, K. M. Gharpure, H. Hatakeyama, M. Egli, M. H. McGuire, A. S. Nagaraja, T. M. Miyake, R. Rupaimoole, C. V. Pecot, M. Taylor, S. Pradeep, M. Sierant, C. Rodriguez-Aguayo, H. J. Choi, R. A. Previs, G. N. Armaiz-Pena, Li Huang, C. Martinez, T. Hassell, C. Ivan, V. Sehgal, R. Singhania, H.-D. Han, C. Su, Ji Hoon Kim, H. J. Dalton, C. Kovvali, K. Keyomarsi, N. A. J. McMillan, W.illem W. Overwijk, Jinsong Liu, Ju-Seog Lee, Keith A. Baggerly, Gabriel Lopez-Berestein, Prahlad T. Ram, Barbara Nawrot, Anil K. Sood. 2’-OMe-phosphorodithioate-modified siRNAs show increased loading into the RISC complex and enhanced anti-tumour activity. Nature Communications, 2014, 5: 3459.
34. P. Bartos, A. Maciaszek, A. Rosinska, E. Sochacka, B. Nawrot. Transformation of a wobble 2-thiouridine to 2-selenouridine through S-geranyl-2-thiouridine as a likely pathway in the cell. Bioorganic Chemistry, 2014, 56: 49-53.
35. A. Rosinska, A. Maciaszek, P. Bartos, E. Sochacka, B. Nawrot. Chemical transformation of 2-thiouridine into 2-seleno-uridine via newly discovered S-geranyl-2-thiouridine. Proceedings Collection Symposium Series, 2014,14: 358-360.
36. P. Bartos, L. Piotrowski, B. Nawrot, G. Pratviel, E. Sochacka. The possible pathway of oxone-mediated desulfuration of 2-thiouridine. Proceedings Collection Symposium Series, 2014,14: 163-166.
37. A. Krakowiak, R. Pawłowska, B. Kocoń-Rębowska, R. Dolot, W.J. Stec: Interactions of cellular histidine triad nucleotide binding protein 1 with nucleosides 5′-O-monophosphorothioate and their derivatives — Implication for desulfuration process in the cell. Biochim. Biophys. Acta, 2014, 1840: 3357-3366. (IF 4.381).
38. M. Sierant, Xianbin Yang, B. Nawrot: siRNA Analogs Containing Phosphorodithioate Substitutions. Phosphorus, Sulfur, and Silicon and the Related Elements 2013, 188(4): 427-436
39. A. Kwiatkowska, M. Sobczak, B. Mikolajczyk, S. Janczak, A. B. Olejniczak, M. Sochacki, Z. J. Lesnikowski, B. Nawrot. siRNAs modified with boron cluster and their physicochemical and biological characterization. Bioconjugate Chem. 2013, 24: 1017-1026 (2013) (IF2012 4.580; 40 pkt)
40. R. Dolot, A. Wlodarczyk, G. D. Bujacz, B. Nawrot. Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of human histidine triad nucleotide-binding protein 2(hHINT2). Acta Crystallographica F. 2013, 69: 783-787. (IF2012 0.552; 15 pkt)
41. E. Sochacka, P. Bartos , K. Kraszewska, B. Nawrot. Desulfuration of 2-thiouridine with hydrogen peroxide in the physiological pH range 6.6-7.6 is pH-dependent and results in two distinct products. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23: 5803-5805. (IF2012 2.427; 30 pkt)
42. M. Sobczak, T. Johansson, M. Bulkowski, M. Sochacki, G. Lavén, B. Mikolaczyk, J. Stawinski, B. Nawrot: DNA oligonucleotides with stereodefined phenylphosphonate and phosphonothioate internucleotide bonds: synthesis and physico-chemical properties. Arkivoc 2012, (iv): 63-79. (IF 1.096)
43. Xianbin Yang, M. Sierant, M. Janicka, L. Peczek, C. Martinez, T. Hassell, Na Li, Xi Li, T. Wang, B. Nawrot : Gene silencing activity of siRNA molecules containing phosphorodithioate substitutions. ACS Chem. Biol. 2012, 7: 1214-1220. (IF 6.446)
44. A. Tomaszewska, S. Mourgues, P. Guga, B. Nawrot, G. Pratviel: A single nuclease-resistant linkage in DNA as a versatile method for the characterization of DNA lesions: application to the guanine oxidative lesion “G+34” generated by metalloporphyrin/KHSO5 reagent. Chem. Res. Toxicol. 2012, 25: 2505-2512. (IF 3.799)
45. R. Dolot, M. Ozga, A. Włodarczyk, A. Krakowiak, B. Nawrot: A new form of human histidine triad nucleotide-binding protein 1 (hHINT1) in complex with adenosine-5′-monophosphate at 1.38Å resolution. Acta Cryst. F 2012, F68: 883-888. (IF 0.506)
46. A. Krakowiak, I. Fryc: Rodzina białek triady histydynowej (HIT) – aktywność enzymatyczna a funkcja biologiczna. Postępy Biochem. 2012, 58: 302-313.
47. E. Sochacka, K. Kraszewska, M. Sochacki, M. Sobczak, M. Janicka, B. Nawrot: The 2-thiouridine unit in the RNA strand is desulfured predominantly to 4-pyrimidinone nucleoside under in vitro oxidative stress conditions. Chem. Commun. 2011, 47: 4914–4916. (IF 5.787)
48. M. Sierant, Xianbin Yang, M. Janicka, Na Li, C. Martinez, T. Hassell, B. Nawrot: siRNAs with Phosphorodithioate Modification. Coll. Symp. Ser. 2011, 12: 135-139.
49. R. Dolot, M. Ozga, A. Krakowiak, B. Nawrot: High-resolution X-ray structure of the rabbit histidine triad nucleotide-binding protein 1 (rHINT1)-adenosine complex at 1.10 Å resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2011, 67(Pt 7): 601-607. (IF 6.326)
50. M. Sierant, A. Paduszynska, J. Kazmierczak-Baranska, B. Nacmias, S. Sorbi, S. Bagnoli, E. Sochacka, B. Nawrot: Specific Silencing of L392V PSEN1 Mutant Allele by RNA Interference. International Journal of Alzheimer’s Disease Volume 2011, Article D809218, 14 pages.
51. A. Krakowiak, R. Pęcherzewska, R. Kaczmarek, A. Tomaszewska, B. Nawrot, W. J. Stec: Evaluation of influence of Ap(4)A analogues on Fhit-positive HEK293T cells; cytotoxicity and ability to induce apoptosis. Bioorg. Med. Chem. 2011, 19: 5053-5060. (IF 2.978)
52. B.Nawrot, E. Sochacka, M. Duechler: tRNA structural and functional chanmges induced by oxidative stress. Cell. Mol. Life Sci. 2011, 68(24): 4023-4032 (IF 6.57)
53. K. Ebenryter, S. Jankowski,J. Karolak-Wojciechowska, A. Fruziński, J. Kaźmierczak-Barańska, B. Nawrot, E. Sochacka: 2-Thiozebularine: base modified nucleoside fully constrained in 3’-endo conformation in solution. Coll. Czech. Chem. Commun. 2011, 76: 1103-1119.
54. M. Sobczak, K. Kubiak, M. Janicka, M. Sierant, B. Mikołajczyk, W. J. Stec, B. Nawrot: Synthesis, physico-chemical and biological properties of DNA and RNA oligonucleotides containing short non-ionic internucleotide bond. Coll. Czech. Chem. Commun. 2011,76(12)) 1471-1486.
55. R. Pruzan, D. Zielinska, B. Rebowska-Kocon, B. Nawrot, S. M. Gryaznov: Stereopure oligonucleotide phosphorothioates as human telomerase substrates. New J. Chem. 2010, 34: 870-874. (IF 2.631)
56. Smuga, K. Majchrzak, E. Sochacka, B. Nawrot: RNA-cleaving deoxyribozyme 10-23 with amino acid-like functionality operates without metal ion cofactors. New J. Chem. 2010, 34: 934-948. (IF 2.631)
57. J. J. Wrzesinski, A. Wichlacz, D. Nijakowska, B. Rebowska, B. Nawrot, J. Ciesiolka: Phosphate residue of antigenomic HDV ribozyme important for catalysis that are revealed by phosphorothioate modification. New J. Chem. 2010, 34: 1018-1026. (IF 2.631)
58. M. Sierant, J. Kazmierczak-Baranska, A. Paduszynska, M. Sobczak, A. Pietkiewicz, B. Nawrot: Longer 19-Base pair short interfering RNA Duplexes Rather Than Shorter Duplexes Trigger RNA Interference. Oligonucleotides 2010, 20(4): 199-206. (IF 2.986)
59. B. Nawrot, M. Sierant, A. Paduszyńska: Emerging drugs and targets for Alzheimer´s disease. Vol.2. RSC Publishing (ed. A. Martinez) chapter 26, 2010, 2: 228-268.
60. M. Ozga, R. Dolot, M. Janicka, R. Kaczmarek, A. Krakowiak: Histidine triad nucleotide-binding protein 1 (HINT-1) phosphoramidase transforms nucleoside 5′-O-phosphorothioates to nucleoside 5′-O-phosphates. J. Biol. Chem. 2010, 285: 40809-40818. (IF 5.33).